Estudios estructurales y funcionales de la DNA polimerasa y la proteína terminal del bacteriófago φ29

Resumo

El fago ¿29 tiene un genoma lineal de DNA de doble cadena con una proteína terminal (TP) unida covalentemente a los extremos 5¿ (TP-DNA) que junto con una secuencia específica constituye los orígenes de replicación. Para iniciar la replicación, la DNA polimerasa forma un heterodímero con una TP libre y reconoce el origen de replicación usando como iniciador el grupo hidroxilo de la Ser232 de la TP. La resolución de la estructura cristalográfica del heterodímero DNA polimerasa/TP de ¿29, ha permitido la identificación de residuos de la TP que podrían ser responsables de la interacción con la DNA polimerasa. Ensayos realizados mediante análisis in vitro de mutantes puntuales en dichos residuos, mostraron que su sustitución tiene efecto tanto en la estabilidad del complejo TP/DNA polimerasa (R158A) como en la interacción funcional de la TP en el centro activo de polimerización de la DNA polimerasa (R169A, E191A, Y250A, E252A, Q253A y R256A), afectando a los primeros pasos de la replicación y permitiéndonos proponer un papel de estos residuos en el mantenimiento del equilibrio entre la estabilización del dominio iniciador de la TP y su salida gradual del centro activo de polimerización de la DNA polimerasa a medida que el nuevo DNA está siendo sintetizado. Los ensayos realizados en esta Tesis con mutantes en la Lys529 de la DNA polimerasa de ¿29 mostraron su papel en garantizar la estabilización de la cadena iniciadora en el centro activo de polimerización, y como consecuencia, en la inserción del nucleótido entrante. La Lys529 también es crítica en el paso de translocación requerido para la incorporación del siguiente nucleótido. Además, podría estar regulando la actividad exonucleasa de la DNA polimerasa, actuando como una barrera para prevenir el exceso de degradación del sustrato. Ensayos realizados combinando estos mutantes de la DNA polimerasa con mutantes en el residuo Glu233 de la TP nos permiten proponer que se requiere un contacto directo entre la Lys529 y el Glu233 para la iniciación de la replicación del TP-DNA y su posterior translocación para completar la replicación del genoma. La iniciación de la replicación del DNA de ¿29 ocurre frente al segundo nucleótido en 3¿ de la cadena molde. Estudios previos mostraron que el dominio iniciador de la TP es el responsable de dictar la posición del molde usada para dirigir la reacción de iniciación. Los resultados obtenidos utilizando quimeras en las que se intercambiaron las hélices del dominio iniciador de la TP de ¿29 con las correspondientes al fago relacionado Nf, así como mutantes de la TP del priming-loop de los fagos ¿29 y Nf en los que se modificó la posición del residuo aromático, mostraron que el principal determinante estructural para dirigir el nucleótido interno en 3¿ usado como molde en la reacción de iniciación en ¿29 es el residuo aromático Phe230 del priming-loop.